2024年3月，印尼科研人員通過分析來自爪哇島的一根動物毛髮，宣佈已經滅絕數十年的爪哇虎可能仍有野生個體存活。該結果發表於國際學術期刊Oryx，引發了學界和公衆的廣泛關注。然而，在對該研究公佈的“爪哇虎”DNA序列進行深入分析後，我們發現數據存在嚴重問題，無法支持爪哇虎仍然存在的結論。相關的分析和結果已於近日在Oryx在線發表。

爪哇虎的滅絕

虎（Panthera tigris）是世界上體型最大的貓科動物，曾廣泛分佈於亞洲大部分地區。然而，由於棲息地喪失、獵物銳減以及捕殺和偷獵等原因，野生虎的數量從20世紀初約10萬隻急劇下降至當前約4000只。

現代虎的9個亞種中，巴釐虎（P. t. balica）、裏海虎（P. t. virgata）和爪哇虎（P. t. sondaica）分別於上世紀40、70和80年代滅絕，野外杳無蹤跡的華南虎（P. t. amoyensis）現存約200只的圈養種羣。野外僅存的5亞種——東北虎（P. t. altaica）、印支虎（P. t. corbetti）、馬來虎（P. t. jacksoni）、蘇門答臘虎（P. t. sumatrae）和孟加拉虎（P. t. tigris）——分佈在支離破碎的棲息地中，瀕臨滅絕。如何有效保護野生虎，甚至在其歷史分佈區內實現重引入，已成爲全球野生動物保護領域面臨的重大挑戰和遠景目標。

虎的9個亞種，包括已滅絕的3亞種和現存的6亞種 （圖片來源：Wildlife Friends Foundation，作者漢化）

虎的9個亞種及其歷史和現存分佈區 （圖片來源：作者供圖）

爪哇虎（見下圖）是位於東南亞巽他羣島上3個島嶼特有的虎亞種之一，僅分佈於爪哇島。與東北虎、孟加拉虎等大陸亞種相比，爪哇虎體型較小，更接近蘇門答臘虎和巴釐虎。歷史上，爪哇虎曾廣泛棲息於島上森林和草原。隨着當地人口增長、荷蘭殖民者入侵，爪哇虎的棲息地遭到嚴重破壞，種羣數量急劇下降。同時人獸衝突引發人爲捕殺，進一步加劇了下降趨勢。

到了1950年代中期，爪哇島全島僅剩25至50只野生虎。1972年，印尼政府在爪哇島東南部設立保護區，但爲時已晚。1979年，保護區內僅剩3只虎。自1980年代以來，儘管偶有目擊傳聞，但均未能證實。2008年，世界自然保護聯盟（IUCN）正式宣佈爪哇虎滅絕。

爪哇虎 （圖片來源：wikipedia）

意料之外的重現？

儘管爪哇虎滅絕已數十載，但是像許多“明星”物種一樣，仍有人相信其神祕的存在，並孜孜不倦地尋找它的蹤跡。自2008年以來，多次有報道稱在爪哇島發現老虎或其痕跡，不過因缺乏確鑿證據，始終未能得到證實，直到五年前的一次目擊傳聞再次點燃人們的希望。

2019年8月18日，在爪哇島西部South Sukabumi地區Cipendeuy村，當地一位動物愛好者Ripi Yanur Fajar稱，他在村裏種植園發現了一隻疑似虎的動物，見到它一躍而出，消失在森林裏。27日，研究人員Kalih Raksasewu來到現場勘查。他們發現了腳印和爪痕，還在道路與種植園之間的圍欄上找到一根疑似虎毛的動物毛髮（見下圖）。“根據現場，我判斷老虎跳出園子時，毛髮可能會被圍欄掛住”，Raksasewu告訴記者，“果然，我猜對了！”

Kalih Raksasewu等人在種植園圍欄上採集的疑似虎毛的動物毛髮 （圖片來源：參考文獻[1]）

和以往的目擊報道不同，這次從現場採集到的毛髮提供了可供檢驗的證據。研究人員可利用分子生物學技術對毛髮進行DNA提取和分析，從而判斷是否確實來自爪哇虎。

爪哇虎的“虎毛”？

2024年3月21日，印尼研究者Wirdateti等人完成了對這根疑似“爪哇虎毛”的DNA分析，並將數據和結果發表於生態和保護生物學領域的國際學術期刊Oryx，宣告爪哇虎“重現”世間。

Wirdateti等人沿用常規的分子生物學技術流程，從疑似“虎毛”提取DNA，對線粒體的細胞色素b基因片段進行PCR（聚合酶鏈式反應）擴增，隨後通過測序獲得讀長爲1043鹼基對的DNA序列。作者還從博物館一份採集於1930年的“標準”爪哇虎標本的毛髮中提取DNA並獲得相應的測序數據。作者將實驗獲得的“疑似”和“標準”爪哇虎毛的兩段DNA序列，和已經發表的虎和豹的DNA序列進行比對，以分析毛髮的物種來源。

根據Wirdateti等人的分析，來自疑似“爪哇虎毛”的序列與來自蘇門答臘虎、孟加拉虎、東北虎和爪哇豹的序列之間的遺傳距離分別爲0.074 ± 0.009、0.071 ± 0.009、0.072 ± 0.009和0.088 ± 0.010，而與他們從博物館“標準”爪哇虎標本獲得的DNA序列之間的遺傳距離僅爲0.040 ± 0.006。基於線粒體DNA序列構建的系統發生樹中（見下圖），疑似“爪哇虎毛”與博物館“標準”爪哇虎聚爲一枝，相對於其他樣本，二者親緣關係最近。

綜合以上結論，難道2019年採集的這根“虎毛”真的來自爪哇虎？

修改自Wirdateti論文中的系統發生樹，顯示疑似“爪哇虎”線粒體DNA序列相對於其他虎亞種的位置存疑。數字表示該分支聚類的統計檢驗支持百分比程度。圖中只展示了序列之間的拓撲結構，枝長沒有實際意義。（圖片來源：參考文獻[2]）

Wirdateti等人題爲“爪哇虎仍然存在？關於最近一根毛髮的DNA分析”的文章一經發表，迅速引起了廣泛的關注。根據學術研究影響力評價網站Altmetric，在文章發表的1個月後，該研究就已經被5個維基百科詞條參考引用，並收穫了來自全球83家媒體至少93份新聞稿的報道。這項研究的影響力評分已躋身Altmetric數據庫中所有學術成果的前5%。

奇怪的“爪哇虎”DNA序列

但問題總是隱藏在角落中。從表面上看，Wirdateti等人的論文似乎已經對疑似“虎毛”的物種來源做了詳盡的論證，甚至通過了同行評議而發表於著名的國際學術期刊。然而，經過仔細的審閱和針對文章數據的重分析，我們對該結論提出了質疑。

我們課題組從事虎的遺傳和演化研究20多年，奠定了虎亞種劃分的分子遺傳學基礎[3]，也是馬來虎亞種的發現和定名者[4]。Wirdateti等人在文章中引用了16條公開發表的虎線粒體DNA序列，就有11條來自我們的數據[4][5]。不過他們沒有引用我們2023年最新發表的古代虎基因組數據[6]，其中已包括一份來源確鑿的爪哇虎樣本的線粒體基因組序列。

修改自本文作者團隊2023年發表的基於不同虎亞種及古虎的線粒體基因組數據所構建的系統發生樹，其中SON1和BAL1分別來自爪哇虎和巴釐虎的博物館標本的DNA。

（圖片來源：參考文獻[6]）

修改自本文作者團隊2015年發表的基於虎線粒體基因組中4078bp同源序列構建的單倍型統計網狀圖，其中包括了9只爪哇虎及2只巴釐虎。

（圖片來源：參考文獻[5]）

如以上兩圖所示，在2015年和2023年的研究中我們證明，爪哇虎與同樣分佈於巽他羣島的蘇門答臘虎和巴釐虎親緣關係最近，而與其他大陸虎各亞種之間的遺傳距離較遠。然而，在Wirdateti等人構建的線粒體DNA系統發生樹中，不論是來自博物館的“標準”爪哇虎，還是採集自種植園圍欄的“爪哇虎毛”，都出乎意料地沒有和蘇門答臘虎聚爲一枝，反而成爲獨立於所有虎的演化單系羣的外羣，與各虎亞種距離甚遠。這顯然與爪哇虎在現代虎中的演化地位是相悖的。

爲了探究原因，我們下載了Wirdateti等人發表的這兩段異常“爪哇虎”序列，並整合其他虎和其他豹屬物種（美洲豹、雪豹、獅、豹）的線粒體DNA序列，重新進行序列比對和系統發生分析。

重構的系統發生樹幾乎重現了Wirdateti等人發表的異常現象（見下圖）。爲了能更直觀地展示DNA序列之間的差異水平，我們保留了系統發生樹的枝長信息。此時，上述提到Wirdateti等人報道的兩條“爪哇虎”線粒體DNA序列的異常顯得更加突兀：與豹屬物種相比，來自不同虎亞種的標準序列緊密聚爲一枝，且彼此之間的序列相似度非常高；然而，來自Wirdateti等人發表的兩條“爪哇虎”序列則與其他所有虎線粒體DNA序列距離極遠。

具體而言，已發表的確定虎線粒體DNA序列之間的平均遺傳距離僅爲5.645×10-3 ± 2.73×10-3，而疑似“爪哇虎毛”的序列與虎線粒體DNA序列之間的平均距離高達0.07353 ± 2.872×10-3，是前者的13倍以上，幾乎達到不同物種之間的差異水平。這樣顯著的異常表明，Wirdateti等人發表的DNA序列並非來自虎的線粒體，更勿論爪哇虎。

修改自作者團隊基於已有豹屬線粒體序列及Wirdateti等人發表的異常序列重新構建的系統發生樹，樹中兩條“爪哇虎”序列與其他虎線粒體DNA序列距離很遠。數字表示該分支點的Bootstrap檢驗支持百分比。

（圖片來源：參考文獻[7]）

“遠房親戚”真假難辨

問題出在哪裏呢？我們想到一個可能性：會不會是Numt作怪？

Numt（Nuclear mitochondrial DNA），即細胞核內線粒體DNA。它指的是細胞質中的線粒體DNA（Cytoplasmic mitochondrial DNA，簡稱Cymt）部分拷貝並轉移到核基因組中所形成的假基因序列。這些轉移到核基因組中的Numt通常不再具有基因功能，而是作爲遺傳信息的“化石”保存在覈基因組中。儘管Cymt和Numt具有同源相似性，但它們在漫長的時間裏獨立演化，積累了相當的遺傳差異。在PCR反應中，如果使用了非Cymt特異的引物，就可能導致Numt的非特異性擴增，給測序造成嚴重的干擾。豹屬物種Numt干擾情況已經在此前被多次報道。在常用的公共數據庫GenBank中，至今仍存在虎的Numt序列被錯誤標註爲Cymt的情況。

修改自2006年對豹屬物種Numt現象的研究，說明了豹屬物種（豹、雪豹、獅、美洲豹、虎）核基因組普遍存在Numt，且與Cymt序列差異較大。

（圖片來源：參考文獻[8]）

爲了驗證這一假設，我們將Wirdateti等人報道的兩段異常序列與虎的Cymt和Numt序列進行了相似性比較。正如我們所預料，這兩段所謂“爪哇虎”的線粒體DNA序列都與虎核基因組F2染色體上的一段Numt序列具有很高的相似度（>97.4%），顯著高於它們與虎Cymt序列的相似度（<92.5%）。這一結果表明，儘管Wirdateti等人旨在通過PCR獲取樣本中的Cymt片段，但遺憾的是，他們最終得到的序列卻更像受到了來自Cymt的“遠房親戚”——Numt的干擾和污染。

即便是DNA污染，但還是虎？

讀者可能會提出一個問題：即便不是虎的線粒體，是否仍然可以是虎的DNA呢？在我們文章投稿後，評審人也曾提出類似的疑問。對此，我們進行了更深入的探討。

古DNA實驗需在專用的無污染實驗室中進行，並嚴格遵循規範化的操作流程。

（圖片來源：北京大學羅述金實驗室）

Wirdateti等人報道的這兩段異常序列存在更多的疑點。疑似“爪哇虎毛”的DNA序列與他們博物館採集的“標準”爪哇虎序列之間，平均每千鹼基對竟存在多達24.7個變異位點。這一數值遠高於兩個虎基因組之間的差異。

作爲參考，我們從爪哇虎、巴釐虎和蘇門答臘虎等三種巽他羣島亞種15.5kb的線粒體基因組序列中，僅發現44個變異位點，相當於平均每千鹼基對2.84個變異位點。虎核基因組的變異位點頻率更低，不同亞種間每千鹼基對僅相差0.26-0.72個位點。Wirdateti等人報道的兩條所謂“爪哇虎”序列間的差異如此之大，表明即便是來自虎的核基因組區域，也不可能擴增自虎基因組中的同源區域。

在Wirdateti等人的研究中，疑似“爪哇虎毛”的樣本僅有一根，另外一份來自博物館的爪哇虎標本已有近百年曆史。涉及古舊或痕量生物樣本的研究，從樣品處理、DNA提取到實驗操作，每一個環節都必須嚴格規範，避免交叉污染，以確保研究結果的可靠性和準確性。這也是我們課題組分別於2015年[5]和2023年[6]從博物館爪哇虎標本中獲得線粒體部分序列以及線粒體基因組數據的操作規範。然而，由於Wirdateti等人沒有提供數據質量控制的相關信息，我們無法確定究竟是什麼原因導致了數據的異常。

總之，該研究存在着嚴重的數據質量問題。這些數據無法作爲爪哇虎仍然存在的有效證據。序列來源尚且存疑，基於這些數據判斷是否來自爪哇虎，更是無從談起。

幻滅之後的故事

“在印尼，當你提到‘森林之王’，不言而喻，所有人都知道你說的是老虎。”Wirdateti如此向記者描述。而在中國及亞洲的許多地區，虎同樣承載着“百獸之王”的象徵意義，深植於傳統和藝術之中，倍受尊崇。或許正是這種文化根源和情感，令公衆對虎的消失感到深深的遺憾與失落，也使得一些人傾向於相信山林中仍有虎嘯長吟。然而，現實往往難以與人們的美好期待相符。

2024年4月17日，在Wirdateti等人的論文發表於Oryx之後27天，我們聯合從事虎的演化和保護工作多年、現今在馬來西亞、丹麥、美國、德國、中國等國的同事，將對該研究的質疑、分析和論證整理成文，提交到Oryx編輯部。經過同行評審和修改，於12月6日在線發表。我們深入分析了原文存在的問題，提出了反駁的論證，明確指出爪哇虎此次“重現”沒有可靠證據支持。

本文作者團隊在線發表論文（圖片來源：Oryx）

和所有人一樣，我們初看到新聞時，也爲曾宣告滅絕多年的爪哇虎可能復現感到驚喜和激動。然而，捍衛科學的原則是研究工作者的底線。唯有以嚴謹和客觀爲準繩，科學研究才能爲瀕危物種的保護提供可靠的依據，避免更多物種滅絕的悲劇上演。

參考文獻：

[1] Jon Emont. (2024). A Late-Night Sighting, and a Single Hair, Rekindle Hopes That an Extinct Tiger Lives On. The Wall Street Journal.

https://www.wsj.com/science/javan-tiger-extinct-dna-2cf84d7d?msockid=1830c26815e96e130ebad60814fc6f0f

[2] Wirdateti, W., Yulianto, Y., Raksasewu, K., and Adriyanto, B. (2024). Is the Javan tiger Panthera tigris sondaica extant? DNA analysis of a recent hair sample. Oryx.

https://www.cambridge.org/core/journals/oryx/article/is-the-javan-tiger-panthera-tigris-sondaica-extant-dna-analysis-of-a-recent-hair-sample/5F407FD1D97836F8C26DE46CCFA08D73

[3] Liu, Y.-C., Sun, X., Driscoll, C., Miquelle, D.G., Xu, X., Martelli, P., Uphyrkina, O., Smith, J.L.D., O’Brien, S.J., and Luo, S.-J. (2018). Genome-Wide Evolutionary Analysis of Natural History and Adaptation in the World’s Tigers. Current Biology 28, 3840-3849.e6.

https://www.cell.com/current-biology/fulltext/S0960-9822(18)31214-4

[4] Luo, S. J., Kim, J. H., Johnson, W. E., Walt, J. V. D., Martenson, J., Yuhki, N., ... & O''Brien, S. J. (2004). Phylogeography and genetic ancestry of tigers (Panthera tigris). PLoS biology, 2(12), e442.

https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.0020442

[5] Xue, H.R., Yamaguchi, N., Driscoll, C.A., Han, Y., Bar-Gal, G.K., Zhuang, Y. et al. (2015). Genetic ancestry of the extinct Javan and Bali tigers. Journal of Heredity 106, 247-257.

https://academic.oup.com/jhered/article-abstract/106/3/247/2961850?redirectedFrom=fulltext&login=false

[6] Sun, X., Liu, Y.-C., Tiunov, M.P., Gimranov, D.O., Zhuang, Y., Han, Y., Driscoll, C.A., Pang, Y., Li, C., Pan, Y., et al. (2023). Ancient DNA reveals genetic admixture in China during tiger evolution. Nature Ecology & Evolution 7, 1914–1929.

https://www.nature.com/articles/s41559-023-02185-8

[7] Sui, Z.-Y., Yamaguchi, N., Liu, Y.-C., Xue, H.-R., Sun, X., Nyhus, P., and Luo, S.-J. (2024). No reliable evidence supports the presence of the Javan tiger: data issues related to the DNA analysis of a recent hair sample. Oryx.

https://www.cambridge.org/core/journals/oryx/article/no-reliable-evidence-supports-the-presence-of-the-javan-tiger-data-issues-related-to-the-dna-analysis-of-a-recent-hair-sample/2D906D0A73D5CC7A6C65AA4DD8028BC8

[8] Kim JH, Antunes A, Luo SJ, Menninger J, Nash WG, O’Brien SJ, Johnson WE (2006). Evolutionary analysis of a large mtDNA translocation (Numt) into the nuclear genome of the Panthera genus species. Gene 366(2): 292-302.

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0378111905005597

[9] Jackson, P. and Nowell, K. (2008). IUCN Red List of Threatened Species: Panthera tigris ssp. sondaica. IUCN Red List of Threatened Species.

https://www.iucnredlist.org/species/41681/10509194

作者：睢崢巖 羅述金

作者單位：北京大學生命科學學院